Лабораторная диагностика Конго-Крымской геморрагической лихорадки

Дата: 27.09.2018

«Лабораторная диагностика Конго-Крымской геморрагической лихорадки»

КГЛ – острое вирусное заболевание человека, характеризующееся двухволновой лихорадкой, общей интоксикацией и выраженным тромбогеморрагическим синдромом, с высокой летальностью.

Инфицирование человека происходит при укусе зараженных клещей, через кровь и кровянистые выделения больного, при попадании вируссодержащего материала на кожу и слизистые, в результате попадания содержимого клещей на открытые части тела во время стрижки и ручной очистки скота от клещей, при работе с вирусом ККГЛ в лабораторных условиях, при уходе и оказании медицинской помощи больным;

Возбудителем ККГЛ является вирус, принадлежащий к семейству Bunyaviridae, род Nairovirus. Основными переносчиками возбудителя ККГЛ являются клещи Hyalomma asiaticum. Существенную роль в эпидемиологии ККГЛ играют клещи Dermacentor niveus, обитающие на юге Казахстана.

                           Лабораторная диагностика

  1. Лабораторная диагностика ККГЛ осуществляется путем выделения вируса от больного, определения вирусного антигена и специфических антител с помощью иммунологических реакций, а также методом полимеразной цепной реакции (далее-ПЦР).
  2. Изоляция вируса ККГЛ из материала взятого от больного и дальнейшая идентификация проводится в лаборатории, отвечающей требованиям работы с возбудителями II- группы  патогенности. Для выделения возбудителя используется кровь больных в остром периоде болезни, внутренние органы (печень, селезенка) и сгустки крови умерших, а также иксодовые клещи, собранные в очагах заболевания.

                         

                  Иммуно ферментный анализ

Необходимые реагенты для постановки иммуноферментного анализа (далее-ИФА): 

  1. планшет для ИФА, в лунках которого адсорбирован АГ к вирусу ККГЛ или  АТ к вирусу ККГЛ;
  2. положительная и отрицательная контрольные сыворотки;
  3. инактивированный АГ ККГЛ;
  4. моноклональные АТ к нуклеопротеину вируса, конъюгированные с ферментом;
  5. субстрат, буферные растворы и разбавитель. Необходимые материалы, не включенные в набор;
  6. автоматические пипетки объёмом 10, 100, 200 и 1000 микролитров (далее-мкл);
  7. аппарат для промывки планшетов;
  8. спектрофотометр для ИФА с длиной волны 450 нанометров (далее-нм);
  9. калькулятор для количественной оценки результатов исследования.

               На первой стадии анализа исследуемые и контрольные образцы инкубируют в лунках с иммобилизованным АГ (или АТ). Имеющиеся в сыворотке специфические АТ к вирусу связываются с иммобилизованным АГ (АТ). Несвязавшийся материал удаляют отмывкой. Связавшийся комплекс выявляют при инкубации с конъюгатом АТ к ККГЛ человека с пероксидазой хрена. После второй отмывки количество связавшегося конъюгата определяют цветной реакцией с использованием субстрата пероксидазы – перекиси водорода и хромогена – тетраметилбензидина. Реакцию останавливают добавлением стоп-реагента и измеряют оптическую плотность растворов в лунках при длине волны 450 нм.

               Оценка результата: интенсивность окрашивания пропорциональна  количеству содержащихся в исследуемом образце иммуноглобулинов к вирусу ККГЛ.

                ИФА для выявления иммуноглобулинов (далее – Ig ) класса М  (Ig M) к вирусу ККГЛ. Принцип метода заключается во взаимодействии Ig  класса М  из исследуемого материала с анти – IgM- АТ, иммобилизированными в лунках полистиролового планшета. Образовавшийся комплекс выявляют с помощью АГ ККГЛ и конъюгата поликлональных АТ к ККГЛ с пероксидазой хрена.

               ИФА для выявления Ig класса G к вирусу ККГЛ. Имеющиеся в сыворотке специфические АТ к вирусу связываются с иммобилизованным АГ. Связавшиеся антитела выявляют конъюгатом АТ к IgG человека с пероксидазой хрена.

               ИФА для выявления вируса ККГЛ в клещах и других вирусосодержащих  материалах. Принцип метода заключается во взаимодействии АГ ККГЛ из исследуемого материала с АТ, иммобилизированными в лунках полистиролового планшета. Связавшийся АГ выявляют с помощью анти-ККГЛ-АТ, меченных пероксидазой хрена (конъюгат). По завершении постановки теста развивается окрашивание, свидетельствующее о присутствии АГ ККГЛ в образце (хромоген).

Проведение ПЦР-исследования

Тест-системы предназначены для выявления РНК вируса КГЛ в гомогенатах клещей, в крови заболевших людей, в секционном материале умерших (печень, селезёнка).

          В связи с высокой чувствительностью метода ПЦР возникает проблема взаимной контаминации исследуемых образцов и контаминации образцов и компонентов набора ранее полученным ампликоном.

          Территориально разделять различные стадии анализа, размещая их в различных помещениях:

  1. помещение для подготовки проб;
  2. помещение для постановки ПЦР;
  3. помещение для анализа результатов.
  1. Для каждой стадии анализа должен быть свой комплект лабораторной одежды, автоматических пипеток, вспомогательных материалов и оборудования.

           Работу на всех этапах проводить только с использованием одноразовых расходных материалов: пробирок, наконечников с фильтрами (для ПЦР-анализа) и других вспомогательных материалов.

  Метод обратной транскриптазы (далее-ОТ) –ПЦР включает два этапа: на первом этапе при температуре 37°С происходит реакция ОТ: специфическое связывание олигонуклеотида-праймера с вирусной РНК и синтез вирусной к ДНК с помощью обратной транскриптазы (ревертазы). На втором этапе проводится ПЦР, включающая три стадии:

1) на первой стадии при температуре 94°С происходит денатурация гибридной двойной цепи РНК- к ДНК, образовавшейся на первом этапе;

2) на второй стадии ПЦР два олигонуклеотида-праймера, строго специфичные (гомологичные) к определённым участкам антипараллельных цепей вирусной РНК и к ДНК, связываются (образуют гибриды с помощью водородных связей) с этими участками нуклеиновой кислоты (далее-НК) (стадия отжига);

3) на третьей стадии при температуре 70-72 °С с участием термофильной ДНК-полимеразы и дезоксинуклеозид-5ў-трифосфатов происходит синтез новых цепей ДНК. Инициация синтеза ДНК происходит в местах связывания олигонуклеотидов-праймеров с вирусной к ДНК, матрицей для синтеза служат исходные цепи вирусной НК (стадия полимеризации).

  1. Таким образом, за цикл (три стадии) происходит удвоение каждой из двух антипараллельных цепей вирусной НК. При проведении 20 таких циклов теоретически происходит увеличение количества исходной ДНК примерно в миллион раз.
  2. Для увеличения чувствительности анализа этап ПЦР проводится в “nested”-варианте: первый раунд – с “внешней” парой олигонуклеотидов-праймеров, второй раунд – с “внутренней” парой олигонуклеотидов-праймеров и аликвотой реакционной смеси ПЦР первого раунда.
  3. Перед выполнением анализа необходимо внимательно ознакомиться с настоящей инструкцией постановки ПЦР.
  4. При подготовке смесей и всех операциях с РНК для лучшей сохранности РНК пробирки обязательно помещать в снежно-водяную баню.
  5. Подготовка образцов – в качестве образцов можно использовать клещей, цельную кровь, взятую с антикоагулянтом, сыворотку крови.
  6. Анализ проводится непосредственно после забора проб. В ином случае забранные пробы до проведения анализа должны хранить при температуре 2-4°С не более 24 ч, либо при температуре минус 30 °С не более 1 месяца.
  7. Подготовку проб проводить в соответствии с инструкцией по применению к набору реагентов для выделения РНК.
  8. Подготовка стандартного раствора РНК вируса КГЛ – из пробирки с водно-спиртовой суспензией РНК после перемешивания на встряхивателе отобрать 50 мкл суспензии, перемешать, выдержать 5 минут (далее – мин), отцентрифугировать при 8000-10000 об./мин 5 мин, супернатант отобрать, осадок подсушить и добавить к нему 50 мкл воды из набора, растворить при встряхивании.
  9. Во многих случаях осадок выделенной РНК визуально неразличим, поэтому все операции по осаждению РНК и промывке осадка проводить аккуратно.
  10. Проведение ОТ – пробирки для проведения ОТ пронумеровать и расположить в штативе во льду, включая две пробирки для положительного и отрицательного контрольных образцов (далее-К+, К–).
  11. В чистую пробирку внести необходимые компоненты реакционной смеси:
  1. раствор ДТТ – 2,0 х n мкл;
  2. раствор хлористого марганца – 1,0 х n мкл;
  3. БФ-РТ – 7,0 х n мкл;
  4. РС № 1 – 5,0 х n мкл;

где n – число исследуемых проб, включая контроли.

  1. Смесь перемешать пипетированием и разнести по 15 мкл в пробирки для ОТ, на льду.
  2. В пробирку № 1 внести 5 мкл К– (дистиллированной воды, очищенной от РНК-аз и ДНК-аз). В остальные пробирки внести по 5 мкл раствора РНК исследуемых образцов. В последнюю пробирку внести 5 мкл К+.
  3. Пробирки инкубировать 1 ч при температуре 42°С.
  4. Проведение первого раунда ПЦР – пробирки для проведения ПЦР (вместимостью 0,5 мл) пронумеровать и расположить в штативе, включая пробирки для контрольных образцов, во льду.
  5. В чистую пробирку объемом 0,5 мл добавить реактивы в следующих количествах:
  1. 2 х БФ – 15,0 х n мкл;
  2. РС № 2 – 10,0 х n мкл,

где n – число исследуемых проб, включая контроли.

  1. Смесь перемешать пипетированием и разнести по 25 мкл в пробирки для ПЦР. В пробирку № 1 добавить 5 мкл раствора из реакционной смеси К–. В остальные пробирки внести по 5 мкл ОТ-продуктов исследуемых проб. В последнюю пробирку внести 5 мкл ОТ-продуктов К+. Содержимое пробирок перемешать, добавить по 20 мкл (каплю) минерального масла.
  2. Пробирки поместить в амплификатор и провести амплификацию по следующей программе:
  1. 94°С – 3 мин – 1 цикл;
  2. 94°С – 20 секунд (далее – сек), 55°С – 20 сек, 72°С – 20 сек– 35 циклов;
  3. 72°С – 3 мин – 1 цикл.
  1. Проведение второго раунда ПЦР– пробирки для проведения ПЦР пронумеровать как для стадии первого раунда ПЦР. Расположить в штативе во льду, включая пробирки для положительного и отрицательного контрольных образцов (К+, К–).
  2. В отдельной пробирке объемом 0,5 мл смешать:
  1. 2хБФ — 15,0 х n мкл;
  2. РС № 3 – 10,0 х n мкл,

где n – число исследуемых проб, включая контроли.

  1. Полученную смесь тщательно перемешать и разнести по 25 мкл в пробирки для ПЦР. Внести во все пробирки по 5 мкл растворов из пробирок 1-го раунда ПЦР.
  2. Материал из пробирки, содержащий К+, перед проведением второго раунда ПЦР следует развести в 50 раз дистиллированной водой, затем внести 5 мкл в РС.
  3. Содержимое пробирок перемешать, добавить по 20 мкл (каплю) минерального масла, поместить пробирки в амплификатор и провести амплификацию по следующей программе:
  1. 94° С – 3 мин– 1 цикл;
  2. 94° С – 20 сек, 55°С – 20 сек, 72°С – 20 сек – 35 циклов;
  3. 72° С – 3 мин – 1 цикл.
  1. Тест-системы хранятся при температуре 2-10 °С. Транспортирование осуществляются всеми видами крытого транспорта в термоконтейнерах с термопакетами с хладагентом. Срок годности тест-систем — 4 месяца со дня выпуска.

 

Автор: Айкодыкова Анар

Филиал Национального центра экспертизы по КЗО

лаборатория особо опасных инфекции

Заведующая лабораторией, врач бактериолог первой категории

25.09.2018г